一种L-异亮氨酸羟化酶基因及其基因工程菌与应用

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能特异性地催化L-异亮氨酸生成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的L-异亮氨酸羟化酶基因，以及含有该基因的基因工程菌。利用该菌株生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸，能够克服提取法存在的提取率低、分离纯化困难、原材料需求量大、成本高等不足；化学合成法反应条件苛刻、步骤多、分离困难收率低的问题；以及酶法转化率低且含有大量α-氨基丁酸等副产物的问题，使得发酵液中仅存在（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸一种构型的4-羟基异亮氨酸，并通过L-异亮氨酸羟化酶编码基因过表达的方法进一步提高转化效率，从而达到简化工艺、降低生产成本的目的。

1.一种编码L-异亮氨酸羟化酶的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的基因编码的L-异亮氨酸羟化酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所
示。
3.一种包含有权利要求1所述的基因的基因工程菌。
4.一种构建权利要求3所述基因工程菌的方法，步骤如下：
以权利要求1所述的L-异亮氨酸羟化酶编码基因为模板、以IDO-3和IDO-4为引物，进
行PCR扩增；
IDO-3：5’-CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3’(Sal 
Ⅰ)
IDO-4：5’-CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’(EcoR Ⅰ)
PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min30个循环，72℃10min
1个循环，反应体系为100μL，取10μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测；
将PCR扩增产物经回收后分别经SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，经电泳、切胶回收后连接
至表达载体pXMJ19，获得重组质粒，然后将其电转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032细胞中，
获得重组菌株。
5.一种利用权利要求3所述菌株通过微生物转化法生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的
方法，包括以下步骤：
（1）种子培养：用接种环将1-2支经新鲜斜面活化的上述基因工程菌，接种至装有100
mL种子培养基的1L挡板摇瓶，于32-37℃，200rpm振荡培养6-8h；
（2）菌体的发酵培养：以5%-10%接种量将步骤（1）的种子培养物接种至装有3L
发酵培养基的5L发酵罐进行发罐培养，发酵温度32-37℃，溶氧维持在20-40%，流加浓度为
60-80%W/V的葡萄糖溶液，流加25%W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵培养6-12h，
按照10%接种量将一级种子液转接入5L自动发酵罐，装液量为3L，溶氧控制在20%-30%，
培养温度33℃，pH控制在7.0左右；
（3）向发酵罐中添加等物质的量浓度的L-异亮氨酸和α-酮戊二酸无菌溶液，使其终浓
度为0.1-0.3mol/L，按步骤（2）继续培养18-24h。
6.如权利要求5所述的一种通过微生物转化法生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的方法，
其特征在于：
所述斜面培养成分为：葡萄糖1.0-5.0g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，NaCl2.0-3.0
g/L，琼脂25g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min；
所述种子培养基成分为：葡萄糖25-30g/L，玉米浆15-30mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，
KH₂PO₄0.5-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.1-0.5g/L，MnSO₄15-30mg/L，FeSO₄10-30mg/L，尿素
2-5g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min；
所述发酵培养基成分为：葡萄糖60-80g/L，K₂HPO₄3.0-5.0g/L，MgSO₄1.0-2.0g/L，
MnSO₄20-50mg/L，FeSO₄20-50mg/L，玉米浆20-50mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，
0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。