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sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸的制备方法

sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸的制备方法

  • 专利类型:发明专利
  • 有效期:不限
  • 发布日期:2020-03-30
  • 技术成熟度:详情咨询
交易价格: ¥面议
  • 法律状态核实
  • 签署交易协议
  • 代办官方过户
  • 交易成功

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  • 技术(专利)类型 发明专利
  • 申请号/专利号 CN201410279967.8 
  • 技术(专利)名称 sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸的制备方法 
  • 项目单位 天津科技大学
  • 发明人 路福平 
  • 行业类别 化学、冶金
  • 技术成熟度 详情咨询
  • 交易价格 ¥面议
  • 联系人 刘宇者
  • 发布时间 2020-03-30  
  • 01

    项目简介

    本发明涉及一种利用高活力磷脂酶A和高活力磷脂酶D催化制备sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(2-DHA-PS)的方法。通过重叠PCR技术实现定向进化,获得高活力磷脂酶A和高活力磷脂酶D;利用高活力磷脂酶A和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS,首先磷脂酰胆碱和丝氨酸在高活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰丝氨酸,然后磷脂酰丝氨酸再与二十二碳六烯酸在高活力磷脂酶A的催化下生成2-DHA-PS。该方法合成的产品中2-DHA-PS的相对含量较高,有效克服了现有合成方法的不足。
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  • 02

    说明书

    1.一种2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,所述方法包括:丝氨酸与磷脂酰胆碱在高
    活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰丝氨酸,磷脂酰丝氨酸与DHA在高活力磷脂酶A2的催化
    下生成2-DHA-PS;所述高活力磷脂酶A2含有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,是氨基
    酸序列如SEQ ID NO:9所示的野生型磷脂酶A2通过定点突变得到的突变体;所述高活力磷
    脂酶D来源于专利CN102286440B。
    2.如权利要求1所述的2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
    (1)将所述高活力磷脂酶D加入pH3.0-6.0的含有丝氨酸、CaCl2的醋酸-醋酸钠缓冲液
    中,与含有磷脂酰胆碱的乙醚等体积混合均匀,在30-50℃下反应6-16小时;其中,反应之
    前高活力磷脂酶D浓度为1.0-4.0U/mL、丝氨酸的浓度为1.0-3.0M、CaCl2的浓度为2.0mM;
    (2)反应结束后静置分层,提取含磷酯酰丝氨酸的有机相;
    (3)在步骤(2)得到的含磷酯酰丝氨酸的有机相中加入二十二碳六烯酸,然后与pH
    4.0-9.0的含有高活力磷脂酶A2、CaCl2的磷酸盐缓冲液等体积混合均匀,在30-50℃下反应
    6-16小时;其中,反应之前磷脂酶A2浓度为10-40U/mL、CaCl2的浓度为2.0mM;
    (4)反应结束后静置分层,提取有机相并加入4-6倍体积的丙酮将生成的2-DHA-PS沉
    淀下来,然后离心分离,收集沉淀并用丙酮洗涤2-4次,即可得到2-DHA-PS产品。
    3.如权利要求2所述的2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述磷脂酰
    胆碱的浓度为0.05-0.3M。
    4.如权利要求2所述的2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述二十二
    碳六烯酸的浓度为0.1-0.4M。
    5.如权利要求1-4任一一项所述的2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,以氨基酸序列
    如SEQ ID NO:9所示的野生型磷脂酶A2代替所述高活力磷脂酶A2
    6.如权利要求1-4任一一项所述的2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,所述高活力磷
    脂酶A2由枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株、毕赤酵母高活力磷脂酶A2游离表达重组
    菌株或毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌株制备。
    7.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,由枯草芽孢杆菌高活力磷
    脂酶A2重组菌株制备所述高活力磷脂酶A2包括以下步骤:
    (1)将野生型磷脂酶A2基因与载体pUC-T连接,构建重组质粒pUC-T-plA2,通过重叠
    PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因,得到如SEQ ID NO:8所示高活力磷脂酶A2突变体编
    码基因;
    (2)将高活力磷脂酶A2突变体编码基因与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43连
    接,构建获得携带有高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组载体;
    (3)将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中,构建获得重组菌株;
    (4)将重组细胞进行发酵制备并提取高活力磷脂酶A2
    (5)提取高活力磷脂酶A2
    8.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,由毕赤酵母细胞表面展示
    高活力磷脂酶A2重组菌株制备所述高活力磷脂酶A2包括以下步骤:
    (1)将野生型磷脂酶A2编码基因与载体pUC-T连接,构建重组质粒pUC-T-plA2,通过
    重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因,得到如SEQ ID NO:8所示高活力磷脂酶A2突变
    体编码基因;
    (2)将高活力磷脂酶A2突变体编码基因序列与毕赤酵母展示载体pPIC9K-Flo相连,得
    到携带高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组载体pPIC9K-Flo-plA2m;
    (3)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母GS115中,得到毕赤酵母细胞表面展示磷脂
    酶A2重组菌株。
    (4)将重组菌株发酵后制备酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂。
    9.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法,其特征在于,由所述毕赤酵母高活力磷
    脂酶A2游离表达重组菌株制备所述高活力磷脂酶A2包括以下步骤:
    (1)将野生型磷脂酶A2基因与载体pUC-T连接,构建重组质粒pUC-T-plA2,通过重叠
    PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因,得到高活力磷脂酶A2突变体编码基因;
    (2)将高活力磷脂酶A2突变体编码基因与表达载体pPIC9K相连,得到携带高活力磷
    脂酶A2突变体编码基因的重组表达载体;
    (3)将重组载体转化入毕赤酵母GS115中,得到重组细胞;
    (4)将得到的重组细胞经遗传霉素筛选,结合磷脂酶A2的酶活测定,得到高活力磷脂
    酶A2的高产菌株;
    (5)将高产菌株进行发酵制备高活力磷脂酶A2
    (6)提取高活力磷脂酶A2
    10.根据权利要求1-4任一一项所述方法制备的2-DHA-PS。
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