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一种鸟蛤贝类线粒体COI基因扩增引物

  • 专利类型:发明专利
  • 有效期:不限
  • 发布日期:2020-03-27
  • 技术成熟度:未知
交易价格: ¥面议
  • 法律状态核实
  • 签署交易协议
  • 代办官方过户
  • 交易成功

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  • 申请号 CN201210332088.8 
  • 公开号 CN102827839B 
  • 申请日 2012/09/04 
  • 公开日 2014/07/09 
  • 申请人 中国海洋大学  
  • 优先权日期  
  • 发明人 于贞贞 李琪 孔令锋  
  • 主分类号 C12N15/11 
  • 申请人地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路238号 
  • 分类号 C12N15/11 
  • 专利代理机构  
  • 当前专利状态 发明专利授权公告 
  • 代理人  
  • 有效性 授权 
  • 法律状态 发明专利授权公告
  •  
  • 01

    项目简介

    本发明利用通用引物扩增得到的66条鸟蛤科mtCOI序列,通过CLUSTALW软件比对分析,在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier5设计5对引物,用216个鸟蛤科个体在10μl体系下重复进行PCR反应试验,最后经琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出一种鸟蛤科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物,其特征是:NGF5’-ACAAATCATAAAGATATTGG-3’NGR5’-TTCAGGGTGTCCGAAGAATCA-3’采用本发明的鸟蛤科贝类线粒体COI引物,可以有效地扩增出鸟蛤科贝类不同物种的目的片段,能够满足鸟蛤遗传多样性研究的需要,同时也能为种质资源保护、养殖业发展提供可靠的分子技术指导。
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  • 02

    说明书

    技术领域本发明涉及一种鸟蛤贝类线粒体COI[the cytochrome c oxidase I]基因扩增引物。背景技术鸟蛤科(Cardiidae)隶属于双壳纲(Bivalvia),异齿亚纲(Heterodonta),帘蛤目(Veneroida),它是最大和最古老的双壳贝类贝类之一。鸟蛤科贝类物种丰富、大小不一,全世界约250种,我国发现的约50种,小的直径约1公分,大的直径能达到15公分(如加利福尼亚的光滑巨鸟蛤)。鸟蛤为世界性分布,常栖息在印度洋-西太平洋海域的浅海中,在新加坡、日本、澳大利亚、马来西亚、印度尼西亚、中国大陆、台湾及南海诸岛等地均有分布。鸟蛤科中许多种类肉味鲜美,营养丰富,具有很高的商业价值,是重要的养殖对象(如滑顶薄壳鸟蛤、加州扁鸟蛤等)。传统的分类主要是依据壳的形状,壳表的颜色,放射肋的数目、二级结构和肋间沟的宽窄来区分鸟蛤科不同物种,例如,单色糙鸟蛤和砂糙鸟蛤其形态学区别为前者较大,放射肋约46条,而后者较小,约有45条放射肋。这些形态学特征可塑性强,受环境影响大,带有很强的主观倾向性,而且本科物种多样性丰富近缘种多,近缘种之间的形态差异细微,所以单利用形态特征对鸟蛤科进行物种分类和系统发育的分析变得异常困难。近年来,利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种快速而有效的方法,其中线粒体COI基因由于具有突变速率适中,单亲遗传等特点成为物种鉴定和研究物种进化关系的理想基因。该基因一经引用就迅速传播开来,在许多物种中得到了成功应用,目前已成为DNA条形码(DNA barcoding)技术在动物类群中的标准基因。因此,利用mtCOI基因对鸟蛤科进行物种鉴定和系统发育分析具有很好的前景。然而贝类mtCOI序列的变异速率明显高于动物的其他类群,软体动物不同物种,即使是近缘种甚至种内不同群体之间的mtCOI序列变异都很大,这就导致了Folmer等人于1994年设计的COI通用引物LCO1490和HCO2198在这一动物类群中的扩增效率极低,有些物种根本无法扩出,阻碍了分子技术的使用。因此,鸟蛤科线粒体COI基因扩增引物的筛选,对利用分子方法鉴定鸟蛤科物种和进行系统发育分析具有重要的意义,同时也能为利用COI基因研究鸟蛤系统地理学、保护鸟蛤科种质资源和选择合适的养殖品种提供技术条件。发明内容本发明目的是提供一种鸟蛤科贝类线粒体COI基因适用性好的扩增引物,它能满足现有技术的上述需求。本发明根据鸟蛤科物种COI基因序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性,通过重复试验,筛选出鸟蛤科贝类COI基因特异性扩增引物。采用本发明的COI基因扩增引物,可以有效的扩增出鸟蛤科不同物种的COI序列,更有利于鸟蛤科的物种遗传多样性的研究。具体实施方式本发明的鸟蛤科贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法采用三个步骤:a、利用COI通用扩增引物(LCO1490F和HCO2198R,Folmer1994)扩增出部分鸟蛤科物种的COI序列;b、从上述得到的鸟蛤科mtCOI序列中,通过比对找出保守的序列片段,合成多套扩增引物序列;c、从合成的多套扩增引物序列中筛选出扩增鸟蛤科线粒体COI基因效果最好的一对引物。下面结合实施例对本发明作进一步说明:1.样品采集:于2000年~2012年,从中国南北沿海共采集鸟蛤科12个属23个种类的216个个体。2.DNA提取:用苯酚-氯仿法对所采集样品进行DNA提取。3.COI通用扩增引物扩增:利用Folmer于1994年设计的COI通用扩增引物LCO1490F:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’HCO2198R:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’对上述采集的鸟蛤科216个个体进行PCR扩增。不同物种的PCR热循环退火温度不同,退火温度范围为42℃~64℃。扩增产物经1.5倍的琼脂糖电泳检测后,送往测序公司进行双向测序。用Lasergene软件将测得的序列进行人工矫正。最终获得8个种66个个体的COI序列,其长度约为700bp,其余个体均未扩增出。4.序列比对:利用CLUSTALW软件将上述测得的66条COI序列进行比对,找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。5.引物合成:根据上述的比对结果,利用引物设计软件Primer Primer5在碱基变异度最小的序列片段设计出5对扩增引物。6.引物扩增:将上述设计的5对扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的鸟蛤科23个种类的216个个体。不同物种的PCR热循环退火温度不同,PCR热循环退火温度范围为48℃~60℃。扩增产物用1.5倍的琼脂糖电泳进行检测。7.引物扩增结果:上述5对扩增引物中,2对引物无法扩增出上述任何鸟蛤个体,1对引物能扩增出8个个体,1对引物能扩增出19个个体,1对引物能扩增出鸟蛤科216个个体中的202个个体,扩增效果非常好。特异性扩增引物序列:经过大量的重复试验,最终筛选出上述扩增鸟蛤科COI基因效果最好的一对引物序列为:NGF5’-ACAAATCATAAAGATATTGG-3,;NGR5’-TTCAGGGTGTCCGAAGAATCA-3’。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为700bp。8.特异性扩增引物扩增条件:上述NGF与NGR扩增引物的10μL PCR反应体系为:1μL10×buffer Mg2+,1μL DNTP(2mM),0.6μL Mgcl2(25mM),1μL引物NGF(10μM),1μL引物NGR(10μM),0.08μL r-Taq(5u/μL),1μL DNA模板,4.32μL双蒸水。PCR热循环的退火温度为48℃~60℃。NGF:5’-ACAAATCATAAAGATATTGG-3’NGR:5’-TTCAGGGTGTCCGAAGAATCA-3’
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专利技术附图

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