一种综合利用Cohn组分IV的方法

本发明公开了一种从组分IV中提取人血清白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、α

1.一种综合利用组分IV的方法，其特征在于，所述方法包括步骤a：将Cohn低温乙醇法获得的组分IV溶液I溶解，分离沉淀，获得上清I和沉淀I，将所述沉淀I溶液II溶解，分离沉淀，获得上清II和沉淀II，再将所述沉淀II溶液III溶解，分离沉淀，获得上清III；其中，优选地，所述溶液I为酸性缓冲溶液，pH值为优选地3.8-5.2、更优选地4.1-4.8、最优选地4.3-4.5，浓度为优选地0.01M-0.5M、更优选地
0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M，所述溶液II为中性缓冲溶液，pH值为优选地6.0-7.5、更优选地6.3-7.2、最优选地6.5-7.0，浓度为优选地0.01M-0.5M、更优选地0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M和/或所述溶液III为碱性缓冲溶液，pH值为优选地8.0-9.5、更优选地8.3-9.2、最优选地8.5-9.0，浓度为优选地
0.01M-0.5M、更优选地0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M，且优选地，所述酸性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系和柠檬酸-柠檬酸钠体系、所述中性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于磷酸盐缓冲体系和Tris-HCl缓冲体系和/或所述碱性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于Tris-HCl缓冲体系和硼酸-硼砂缓冲体系；优选地，所述组分IV与所述溶液I、所述溶液II和所述溶液III的质量比分别为1:500-1:1，更优选地1:100-1:2，最优选地1:10-1:4，优选地，所述分离通过离心来进行，优选地，所述步骤a在0-4℃下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤b：将上清I经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分A，之后用洗脱缓冲液I洗脱，获得组分B，最后用洗脱缓冲液II洗脱，获得α₂-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为平衡缓冲液I；其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地
4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤c：将上清II的pH值调节至所述平衡缓冲液I的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分C，之后用所述洗脱缓冲液I洗脱，获得组分D和根据610nm处的特征吸收收集的富含铜蓝蛋白的组分E，最后用所述洗脱缓冲液II洗脱，获得α₂-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液I；其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地
4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤d：将上清III的pH值调节至所述平衡缓冲液I的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分F，之后用所述洗脱缓冲液I洗脱，获得组分G，最后用所述洗脱缓冲液II洗脱，获得α₂-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液I；其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地
4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤e：将组分A、C、F或其组合的pH值调节至平衡缓冲液II的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得免疫球蛋白，用洗脱缓冲液III洗脱获得转铁蛋白，再用洗脱缓冲液IV洗脱获得白蛋白和载脂蛋白A1的混合物，将所述白蛋白和载脂蛋白A1的混合物的盐浓度调节至平衡缓冲液III的盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液V洗脱获得白蛋白，再用洗脱缓冲液VI洗脱获得载脂蛋白A1；其中，离子交换层析柱分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液II，疏水层析分离过程中所使用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III；其中，优选地，所述平衡缓冲液II的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5M、更优选地6.8-7.2M，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄、Na₂SO₄、NaH₂PO₄和Na₂HPO₄，优选地(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄和Na₂SO₄，更优选地(NH₄)₂SO₄的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M，优选地，所述洗脱缓冲液III为在所述平衡缓冲液II中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.06-0.14M、更优选地0.08-0.12M,最优选地0.1M，优选地，所述洗脱缓冲液IV为在所述平衡缓冲液II中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液IV的浓度为0.15-0.35M、优选地0.18-0.3M、更优选地0.20-0.28M，最优选地0.25M，优选地，所述洗脱缓冲液V与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液V的盐浓度为0.25-0.8M、优选地0.3-0.6M、最优选地0.4-0.5M，优选地，所述洗脱缓冲液VI与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VI的盐浓度为0-0.2M、优选地0.01-0.1M、最优选地0.02-0.05M，优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q，优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤f：分别将组分B、D和G的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液III的pH值和盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液VII洗脱组分B、D和G均获得结合珠蛋白，再用洗脱缓冲液VIII洗脱，分别获得α₁-抗胰蛋白酶，组分H和组分I，其中，疏水层析分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III；其中，优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄、Na₂SO₄、NaH₂PO₄和Na₂HPO₄，优选地(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄和Na₂SO₄，更优选地(NH₄)₂SO₄的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地
1.2-0.8M，最优选地1M，优选地，所述洗脱缓冲液VII与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VII的盐浓度为0.6-0.9M、优选地0.75-0.85M、最优选地0.8M，优选地，所述洗脱缓冲液VIII与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VIII的盐浓度为0-0.6M、优选地0.01-0.4M、更优选地0.02-0.1M，最优选地0.05M，优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。
7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤g：将组分D、H或其组合的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液II的pH值和盐浓度，经由亲和层析柱分离，用洗脱缓冲液IX洗脱去除杂质，再用洗脱缓冲液X洗脱获得抗凝血酶III，其中亲和层析分离过程中使用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液IV；其中，优选地，所述平衡缓冲液IV的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5M、更优选地
6.8-7.2M，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，优选地，所述洗脱缓冲液IX为在所述平衡缓冲液IV中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐浓度为0.05-0.25M、优选地0.1-0.2M、更优选地0.15M，优选地，所述洗脱缓冲液X为在所述平衡缓冲液IV中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐的度为0.4-0.6M、优选地0.45-0.55M、更优选地0.5M，优选地，所述亲和层析介质包括但是不限于过程所生产的肝素琼脂糖介质以及GE公司的heparin Sepharose FF。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤h：将组分E的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液III的pH值和盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液VII洗脱获得富含铜蓝蛋白的组分，将所述富含铜蓝蛋白的组分用超滤膜浓缩，之后用凝胶过滤层析柱分离，按照紫外信号收集洗脱峰，获得铜蓝蛋白，其中，疏水层析分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III，凝胶过滤层析分离过程中所用的平衡缓冲液为缓冲液V；其中，优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄、Na₂SO₄、NaH₂PO₄和Na₂HPO₄，优选地(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄和Na₂SO₄，更优选地(NH₄)₂SO₄的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地
1.2-0.8M，最优选地1M，优选地，所述平衡缓冲液V的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系，pH值为5.5-9.9，优选地6.0-8.0、更优选地6.5-7.5、最优选地
6.8-7.2且所述平衡缓冲液IV还含有包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl₂，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述平衡缓冲液IV的盐浓度为0.05-0.4M，优选地0.1-0.25M，更优选地0.15-0.2M，优选地，所述洗脱缓冲液VII与平衡缓冲液III相同，但其中所述另外的盐的浓度为0.6-0.9M、优选地0.75-0.85M、最优选地0.8M，优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub，优选地，所述凝胶过滤层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的快球速琼脂糖介质和魔芋葡糖聚糖介质以及GE公司Sepharose 6FF、Superdex75、Superdex200、Sephadex G 75、Sephacryl 200HR和SephadexG150，优选地，所述超滤膜为截留分子为1-100kDa、优选地5-30kDa、更优选地10kDa的膜包。
9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤i：将组分G、I或其组合的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液VI的pH值和盐浓度，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰获得C1酯酶抑制剂；其中，优选地，所述平衡缓冲液VI的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.0-3.8、优选地3.2-3.6、更优选地
3.4，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地为20-40mM，优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a之后和步骤b-i之前进行步骤j：分别将所述步骤a中的上清I、II、III离心除去助滤剂，之后用微滤膜过滤；其中，优选地，所述离心的离心速度为5000-1000rpm，优选地6000-8000rpm，所述离心的离心时间为10-60min，优选地30-45min；优选地，所述微滤膜的孔径为0.1-1.0μm，优选地0.45μm。