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F‑18标记修饰Dimer‑San A探针的制备方法

F‑18标记修饰Dimer‑San A探针的制备方法

  • 专利类型:发明专利
  • 有效期:2021-04-01至2023-04-01
  • 发布日期:2021-04-01
  • 技术成熟度:详情咨询
交易价格: ¥面议
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  • 技术(专利)类型 发明专利
  • 申请号/专利号 201711070013.6 
  • 技术(专利)名称 F‑18标记修饰Dimer‑San A探针的制备方法 
  • 项目单位
  • 发明人 李玉民 王晓慧 陈凯 
  • 行业类别 人类生活必需品
  • 技术成熟度 详情咨询
  • 交易价格 ¥面议
  • 联系人 王晓慧
  • 发布时间 2021-04-01  
  • 01

    项目简介

    本发明涉及一种F‑18标记修饰Dimer‑San A探针的制备方法,该方法包括以下步骤:⑴制备

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    说明书

    技术领域
    本发明涉及PET显像剂的制备方法,尤其涉及F-18标记修饰Dimer-San A探针的制备方法。
    背景技术
    胰腺癌是世界第五大恶性肿瘤,其中位生存期低于6个月,总的5年生存率低于6%,仅10%的患者适合手术治疗,其预后差与该病未能早期诊断密切相关。随着我国人口的老龄化,胰腺癌在我国的发病率有所增加,其将成为未来几年我国一个主要的健康问题。常规结构影像(包括CT、MRI以及超声检查)不具有特异性;分子影像(Molecular Imaging)是运用影像学手段显示组织水平、细胞、亚细胞水平的特定分子,反应活体状态下分子水平的变化,从而对疾病进行定性与定量的研究,使得疾病的“精准诊断”成为可能。PET/CT(正电子发射型计算机断层显像) 是分子影像的重要成像设备,它的出现,是医学影像学的又一次革命,受到医学界的公认和广泛关注,勘称“现代高科技之冠”,被誉为探测肿瘤的“雷达”,肿瘤诊断的“福尔摩斯”。PET/CT将PET与CT完美融合于一体,将PET的代谢特征与CT成熟的精确解剖信息相结合,二者优势互补,在疾病诊断中能达到1+1>2的效果。        18F-FDG PET/CT的临床应用,大大提高了胰腺癌诊断的准确性。但18F-FDG作为一种肿瘤非特异性显像剂,其自身的局限性也显而易见—在胰腺癌的鉴别诊断方面存在假阳性与假阴性。Meta分析研究显示:18F-FDG PET/CT鉴别诊断胰腺癌与胰腺炎的灵敏度、特异性分别为90%、84%。18F-FDG制备通过自动化化学合成模块(chemistry process control unit,CPCU),采用软件控制自动合成。合成方法是以1,3,4,6-四-氧-乙酰基-2-氧-三氟甲烷磺酰基-β-D-吡喃甘露糖(简称三氟甘露糖)为原料,在相转移催化剂Kryptofix2.2.2(氨基聚醚2.2.2)促进下, 18F离子与三氟甘露糖2位上的羟基发生亲核取代反应,生成18F-FDG保护型的前体,经酸或碱水解脱去乙酰保护基得到18F-FDG。18F-FDG PET/CT作为肿瘤非特异性显像剂,在肿瘤早期良恶性鉴别诊断方面存在明显不足:假阳性与假阴性并存,从而导致肿瘤良恶性诊断的误诊与漏诊。为了克服18F-FDG的不足,有学者标记了CA199抗体片段进行胰腺癌的分子影像诊断,但放射免疫显像不论是使用放射性核素标记单克隆抗体或者其片段,均存在分子量较大,血液清除缓慢(4~20h),在较短时间内难以得到较高的T/NT比值的问题;再者,CA199是胰腺癌非特异性抗原,在胰腺炎性病变中亦有明显表达。受体显像所用的标记配体分子量小、血液清除快、组织穿透力强、T/NT比值高、无免疫原性,具有灵敏度高、特异性强和准确性好等优点,是分子核医学最活跃的前沿研究领域之一。热休克蛋白90(heart shock protein 90,Hsp90)是一种高度保守的在生物界普遍存在、有特殊分子伴侣功能的蛋白,分子量约为83~90KDa。Hsp90含有三个高度保守的结构域:即N端三磷酸腺苷结合域、中间结构域、C末端结构域,以同源二聚体形式存在,主要与细胞周期和细胞凋亡调控相关。研究证实,Hsp90在包括胰腺癌在内的多种恶性肿瘤细胞中异常高表达,是正常细胞的2-10倍,并与肿瘤的发生、发展、分级、分期及预后密切相关;Hsp90在肿瘤细胞质中被激活并定位到细胞表面,而在正常细胞中仅驻留在细胞质中。因此,Hsp90作为一潜在的肿瘤治疗研究靶点日益受到关注,也为其成为靶标的分子影像研究奠定了基础。Sansalvamide A (简称San A) 是1999年由美国Belofsky等从海洋菌属Fusarium中分离出来的一种由两个亮氨酸、一个缬氨酸、一个苯丙氨酸和一个α-羟基异己酸组成的环五肽酯类化合物,具有很高的亲脂性及显著的抗肿瘤能力,其对美国国立癌症研究所的60种恶性肿瘤细胞系具有显著的抗增殖活性,且对包括胰腺癌细胞系在内多种肿瘤细胞具有治疗靶向性。将San A分子中的酯键改造成酰胺键,所得化合物为环五肽(称San A环肽)。研究发现,利用氟、氯、甲氧基等基团取代San A环肽分子中苯环对位氢原子,所得San A 环肽衍生物的抗肿瘤生物活性明显优于San A。San A及其衍生物抗胰腺癌活性的研究,国内尚属空白,而国外研究较多。有学者认为San A具有杀死多种胰腺癌细胞系的重要作用。它的衍生物具有独特的抗癌特性,并与目前抗胰腺癌的药物没有结构同源性。Pan PS等合成了31种San A 环肽衍生物,对两种胰腺癌细胞系(分别是PL45和 BxPC-3)的抗癌活性进行了研究,其中6种衍生物的抗胰腺癌效果是临床常用药物如(如, 5-FU)的140多倍,而正常细胞对其则具有较好的耐受性。到目前为止,合成的San A环肽衍生物有100余种,其抗肿瘤活性差别明显。大量对San A环肽衍生物结构-抗癌效应关系的研究发现,为保证其较高的抗癌活性,该衍生物必须含有两个连续D-氨基酸和/或N-甲氧基。Pan等合成了78种San A环肽衍生物,其中一衍生物(简称Dimer San A),显示出最强的抗胰腺癌PL45活性,当药物浓度为5μM时,对该细胞的生长抑制率达到99%,是报道的抗胰腺癌活性最强的San A环肽衍生物—半数抑制率(IC50)仅为1~20 nM,其结构式为:        。研究证实,San A及其环肽衍生物是Hsp90的抑制剂,其选择性结合于Hsp90的N端及中间解构域,通过阻止Hsp90的C末端结构域与其下游客户蛋白结合,从而干扰涉及细胞生长及肿瘤信号传导的多个通路,导致肿瘤细胞凋亡,且二者结合具有高特异性、高亲和力。为了保持该多肽的生物学活性,我们在保留该类衍生物重要活性功能基团的前提下,通过在Dimer-San A分子的苯环上引入氨基,耦联1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid,NOTA) 双功能螯合剂,对其进行生物学活性鉴定后,实现了正电子放射性核素18F对其进行间接标记(18F-NOTA-Dimer-San A,简称为18F-NOTA-Dimer-San A,其申请号为201710844875.3)。其结构式为:        ;动物实验已经证实原显像剂18F-NOTA-Dimer-San A能够被PL45胰腺癌组织高度摄取。但其脂溶性较高,静脉注射体内后主要通过消化系统排泄,肝脏本底摄取很高。
    发明内容
    本发明所要解决的技术问题是提供一种降低肝脏本底,减少对胰腺疾病诊断可能干扰的F-18标记修饰Dimer-San A探针的制备方法。为解决上述问题,本发明所述的F-18标记修饰Dimer-San A探针的制备方法,包括以下步骤:⑴制备18F-生理盐水溶液:将回旋加速器生产的50~100mCi Na18F溶液先富集于分别经10 mL 0.5 mol/L且pH=8.4的 NaOAc溶液和10 mL去离子水预处理的Sep-Park light QMA柱;然后用5 mL去离子水洗脱除去金属杂质离子;再用0.2 mL~1 mL生理盐水洗脱并收集,得到18F-生理盐水溶液;⑵在5 mL小玻璃瓶内加入乙酸5 μL、0.01 M的AlCl3 12μL 以及10~20 mCi的所述18F-生理盐水溶液50~100 μL,在120℃温度下加热10 min,得到反应液;⑶在1.5 mL EP管内称取NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A多肽100~150 μg,加入250~350 μL乙腈,超声波震荡后充分溶解,再加入40 μL去离子水,得到溶解的多肽;所述溶解的多肽移至所述反应液中,在100~105℃温度下加热10 min后冷却5 min,得到标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A,简称18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A,其结构式如下:        ;⑷所述标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A用悬干机于40℃除去溶剂,并用含有5% DMSO的磷酸盐缓冲液溶解,最后经0.22 μm滤膜过滤,即得备用的胰腺癌分子探针18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A。所述步骤⑶中NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A多肽的结构式为:        。所述步骤⑶中超声波振荡的条件是指温度为37℃,震荡时间为2 min。所述步骤⑷中磷酸盐缓冲液与所述标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A的比例为300~500 μL:100~150 μg。本发明与现有技术相比具有以下优点:1、本发明以Sansalvamide A衍生物中活性最强的环肽Dimer-Sansalvamide A (简称Dimer-San A)作为标记前体(IC50为1-20 nM),其结构式如下:        。在显像剂18F-NOTA-Dimer-San A(申请号:201710844875.3)的基础上,对原有标记前体NOTA-Dimer-San A的水溶性进行了修饰,在Dimer-San A苯环上增加了亲水基团聚乙二醇( Polyethylene Glycol,PEG),并偶联双功能耦合剂NOTA,构建NOTA-(PEG)24-Dimer-San A环肽分子,其结构式为        ;然后对其进行生物学活性鉴定后,实现正电子放射性核素18F对其进行间接标记,合成新型显像剂18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A,通过该修饰,使新的显像剂通过泌尿系统排泄,降低肝脏本底,减少对胰腺疾病诊断的可能干扰。2、本发明18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A Micro-PET显像显示胰腺癌组织高摄取该显像剂,且肝脏本底较18F-NOTA-Dimer-San A摄取明显减低,肾脏摄取显像剂明显增加;体外生物学分布实验结果与显像结果相一致,达到了改善原有显像剂18F-NOTA-Dimer-San A水溶性的目的。3、本发明显像剂18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A以Hsp90作为显像的靶点,经体内外实验证实,其与靶点有较高的结合率,竞争结合实验进一步证实了该显像剂与靶点结合的特异性(参见图1~7)。【体外细胞摄取与阻断实验】将PL45细胞收集并种植到24孔板(0.5×105细胞/孔),放至温育箱培养24 h (37ºC-, 5% CO2)。非阻断实验每孔加入相同浓度的显像剂18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A(5 μCi/100 μL);用于阻断实验的孔先加入100 μL一定浓度的非标记肽,反应120min后再加入相同浓度的显像剂,进行竞争结合反应,用以证实显像剂与靶点结合有无特异性。加样以后将24孔板温浴不同时间(0、15、30、60、90、120min),PBS漂洗游离显像剂,胰酶消化、收集细胞后,用γ计数器检测细胞在不同时间显像剂的摄取情况。上述实验重复两次,每孔设置复孔。图1中摄取高曲线的表示一定浓度的显像剂(18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A)在不同时间的细胞摄取情况,90 min时显像剂摄取达到峰值,细胞结合率为1.84±0.05%;摄取低的曲线表示加入一定阻断剂后细胞摄取下降,90 min时细胞结合率降为:1.24±0.21%。说明显像剂18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A与靶点Hsp90结合具有特异性。【显像】首先构建荷瘤裸鼠模型:待胰腺癌细胞株PL45处于对数增长期时,无菌操作收集细胞,在裸鼠右肩部注射细胞数1×107/只,等肿瘤长至体积100~200 mm3时进行Micro-PET显像。【荷瘤裸鼠显像】用Micro-PET 小动物扫描仪进行显像。裸鼠用2%异氟烷麻醉后,通过尾静脉注射显像剂(18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A)100-200µCi/只,分别于1 h、2 h置于俯卧位进行显像(见图2)。        18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A肿瘤显像:图3~4可见右侧肿瘤部位显像剂摄取增高,肝脏摄取较显像剂18F-NOTA—Dimer-San A明显减低。【荷瘤裸鼠竞争结合显像】裸鼠在注射显像剂前1 h,通过尾静脉注射250 µg阻断剂,分别与1 h、2 h进行俯卧位Micro-PET显像。图5~6可见注射阻断剂后,由于阻断剂与显像剂竞争结合同一靶点,原肿瘤高摄取未见显影。进一步通过体内实验证实了显像剂18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A与靶点Hsp90结合的特异性。【生物学分布实验】将所述荷瘤裸鼠显像的3只动物,完成2h显像后处死,分离血液、心、肝、胰、脾、肾、胆囊、小肠、肿瘤等组织,放入小管,称重,γ计数器测量放射性计数,所得数据经衰减校正后,计算%ID/g(percentage of injected dose per gram of tissue,每g组织注射剂量分数,用来衡量组织器官放射性分布的高低),绘制条形图(参见图7)。从图7可以看出,该显像剂主要通过泌尿系统排泄;其次通过肝脏、胆囊、胃肠道等消化系统排泄,达到了修饰该显像剂的目的。4、本发明标记的前体为环肽二聚体,与线性单体肽相比较,稳定性高,显像效果好。5、本发明易于实施,不需要专门的化学合成模块,成本低。使用“两步法”提高了产率,高效液相色谱(HPLC)结果显示标记率达到25~30%。
    附图说明
    下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。图1为本发明18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A细胞摄取实验及阻断实验结果。图2为本发明胰腺癌荷瘤裸鼠模型(肿瘤大小仅0.5*0.45cm)。图3为本发明荷瘤裸鼠18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A 阳性显像(1 h)。图4为本发明荷瘤裸鼠18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A 阳性显像(2 h)。图5为本发明荷瘤裸鼠18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A 阻断显像(1 h)。图6为本发明荷瘤裸鼠18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A 阻断显像(2 h)。图7为本发明荷瘤裸鼠体内分布实验。
    具体实施方式
    实施例1 F-18标记修饰Dimer-San A探针的制备方法,包括以下步骤:⑴制备18F-生理盐水溶液:将回旋加速器生产的50mCi Na18F溶液先富集于分别经10 mL 0.5 mol/L且pH=8.4的 NaOAc溶液和10 mL去离子水预处理的Sep-Park light QMA柱;然后用5 mL去离子水洗脱除去金属杂质离子;再用0.2 mL~1 mL生理盐水洗脱并收集,得到18F-生理盐水溶液。⑵在5 mL小玻璃瓶内加入乙酸5 μL、0.01 M的AlCl3 12μL 以及10 mCi的18F-生理盐水溶液100 μL,在120℃温度下加热10 min,得到反应液。⑶在1.5 mL EP管内称取NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A多肽100 μg,加入250 μL乙腈,在温度为37℃的条件下超声波震荡2 min后充分溶解,再加入40 μL去离子水,得到溶解的多肽;溶解的多肽移至反应液中,在100℃温度下加热10 min后冷却5 min,得到标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A,简称18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A,HPLC(高效液相色谱)结果显示标记率为25~30%,其结构式如下:        。其中:NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A多肽的结构式为:        。⑷标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A用悬干机于40℃除去溶剂,并用含有5% DMSO的磷酸盐缓冲液溶解,最后经0.22 μm滤膜过滤,即得备用的胰腺癌分子探针18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A。其中:磷酸盐缓冲液与标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A的比例为300 μL:100 μg。实施例2 F-18标记修饰Dimer-San A探针的制备方法,包括以下步骤:⑴制备18F-生理盐水溶液:将回旋加速器生产的100mCi Na18F溶液先富集于分别经10 mL 0.5 mol/L且pH=8.4的 NaOAc溶液和10 mL去离子水预处理的Sep-Park light QMA柱;然后用5 mL去离子水洗脱除去金属杂质离子;再用0.2 mL~1 mL生理盐水洗脱并收集,得到18F-生理盐水溶液。⑵在5 mL小玻璃瓶内加入乙酸5 μL、0.01 M的AlCl3 12μL 以及20 mCi的18F-生理盐水溶液100 μL,在120℃温度下加热10 min,得到反应液。⑶在1.5 mL EP管内称取NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A多肽150 μg,加入350 μL乙腈,在温度为37℃的条件下超声波震荡2 min后充分溶解,再加入40 μL去离子水,得到溶解的多肽;溶解的多肽移至反应液中,在105℃温度下加热10 min后冷却5 min,得到标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A,简称18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A,HPLC(高效液相色谱)结果显示标记率为25~30%,其结构式同实施例1。其中:NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A多肽的结构式同实施例1。⑷标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A用悬干机于40℃除去溶剂,并用含有5% DMSO的磷酸盐缓冲液溶解,最后经0.22 μm滤膜过滤,即得备用的胰腺癌分子探针18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A。其中:磷酸盐缓冲液与标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A的比例为500 μL:150 μg。实施例3 F-18标记修饰Dimer-San A探针的制备方法,包括以下步骤:⑴制备18F-生理盐水溶液:将回旋加速器生产的75mCi Na18F溶液先富集于分别经10 mL 0.5 mol/L且pH=8.4的 NaOAc溶液和10 mL去离子水预处理的Sep-Park light QMA柱;然后用5 mL去离子水洗脱除去金属杂质离子;再用0.2 mL~1 mL生理盐水洗脱并收集,得到18F-生理盐水溶液。⑵在5 mL小玻璃瓶内加入乙酸5 μL、0.01 M的AlCl3 12μL 以及15 mCi的18F-生理盐水溶液80 μL,在120℃温度下加热10 min,得到反应液。⑶在1.5 mL EP管内称取NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A多肽125 μg,加入300 μL乙腈,在温度为37℃的条件下超声波震荡2 min后充分溶解,再加入40 μL去离子水,得到溶解的多肽;溶解的多肽移至反应液中,在103℃温度下加热10 min后冷却5 min,得到标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A,简称18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A,HPLC(高效液相色谱)结果显示标记率为25~30%,其结构式同实施例1。其中:NOTA-(PEG)24-Dimer-Sansalvamide A多肽的结构式同实施例1。⑷标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A用悬干机于40℃除去溶剂,并用含有5% DMSO的磷酸盐缓冲液溶解,最后经0.22 μm滤膜过滤,即得备用的胰腺癌分子探针18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A。其中:磷酸盐缓冲液与标记物18F-NOTA-(PEG)24-Dimer-San A的比例为400 μL:125 μg。

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