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淫羊藿苷和含有淫羊藿苷的淫羊藿黄酮的新用途

淫羊藿苷和含有淫羊藿苷的淫羊藿黄酮的新用途

  • 专利类型:发明专利
  • 有效期:2021-09-01至2023-09-01
  • 发布日期:2021-09-01
  • 技术成熟度:正在研发
交易价格: ¥面议
  • 法律状态核实
  • 签署交易协议
  • 代办官方过户
  • 交易成功

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  • 技术(专利)类型 发明专利
  • 申请号/专利号 201010198154.8 
  • 技术(专利)名称 淫羊藿苷和含有淫羊藿苷的淫羊藿黄酮的新用途 
  • 项目单位 宣武医院
  • 发明人 李林 尹琳琳 林丽莉 张兰 王文 张如意 
  • 行业类别 人类生活必需品
  • 技术成熟度 正在研发
  • 交易价格 ¥面议
  • 联系人 王丽霞
  • 发布时间 2021-09-01  
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    项目简介

    本发明涉及淫羊藿苷和含有淫羊藿苷的淫羊藿黄酮的新用途。具体地说,本发明涉及以下式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮或淫羊藿提取物在制备用于治疗、预防、减轻和/或缓解与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症的药物中的用途,或者在制备用于减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复的药物中的用途:其中,R

    展开
  • 02

    说明书

    技术领域
    本发明属医药技术领域,涉及淫羊藿苷和含有淫羊藿苷的淫羊藿黄酮的新用途,具体涉及淫羊藿苷或者包含淫羊藿苷的淫羊藿、淫羊藿黄酮或淫羊藿提取物的新用途,特别涉及淫羊藿苷或者包含淫羊藿苷的淫羊藿、淫羊藿黄酮或淫羊藿提取物在制备防治神经系统脱髓鞘疾病的药物中的用途。技术背景髓鞘是包裹于有鞘神经纤维轴索外面由髓鞘细胞所构成的一层脂质细胞膜,其主要生理功能是对神经轴索起“绝缘”、保护作用,并有利于神经冲动的快速传导。脱髓鞘病是一组以神经纤维的髓鞘脱失为主要病理改变的疾病,既可累及中枢神经系统,也可累及周围神经系统。这类疾病的主要病理特点为:(1)神经纤维髓鞘破坏,呈多发性小的播散性病灶,或由一个或多个病灶融合而成较大病灶;(2)脱髓鞘病损分布于脑白质、脊髓或周围神经,沿小静脉周围炎性细胞的袖套状侵润。这类疾病包括多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病等;以及由其他原因所引起的脱髓鞘病变,包括但不仅于缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病、糖尿病性神经病(该病多以脱髓鞘改变为主)、系统性红斑狼疮的神经病变(该病变以脱髓鞘改变为主)等。研究有效的减轻髓鞘脱失和促进髓鞘修复的药物,可以为防治各种原因导致的中枢和周围神经系统脱髓鞘疾病提供重要的手段。淫羊藿(Epimedium)为多年生草本小檗科植物,是我国的传统补肾中药。淫羊藿提取物或淫羊藿黄酮(Epimedium flavanoids)是淫羊藿的主要有效组分。淫羊藿黄酮中包括有淫羊藿苷(icariin)、宝藿苷(baohuoside)、朝藿定(epimedin)等,其中淫羊藿苷为其主要活性成分。
    发明内容
    本发明的目的是提供淫羊藿活性成分例如淫羊藿苷以及包含它的淫羊藿、淫羊藿黄酮或淫羊藿提取物的新制药用途。本发明的发明人经过广泛深入研究,发现淫羊藿苷以及包含淫羊藿苷的淫羊藿黄酮具有减轻神经系统髓鞘脱失和炎性细胞侵润、促进髓鞘形成和修复等作用,由此完成了此发明。        发明概述:              本发明第一方面提供以下式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮或淫羊藿提取物在制备用于治疗、预防、减轻和/或缓解与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症的药物中的用途,或者在制备用于减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复的药物中的用途:                      其中,R1选自H、卤素、-C1-6烷基、-C(O)-C1-4烷基。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述式I化合物的R1选自H、F、Cl、Br、-C1-4烷基、-C(O)-C1-2烷基。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述式I化合物为以下式Ia化合物:                      根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述式I化合物为淫羊藿苷。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述淫羊藿、淫羊藿黄酮或淫羊藿提取物包含治疗、预防、减轻和/或缓解有效量的淫羊藿苷。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述淫羊藿按干燥品计,含淫羊藿苷(C33H40O15)不少于0.5%(重量/重量),或者不少于1.0%、2.0%、或5.0%。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述淫羊藿黄酮含淫羊藿苷(C33H40O15)为20-90%(重量/重量),或者为25-85%、30-80%、35-80%、40-80%、45-80%、50-75%、50-70%、30-90%、40-90%、50-90%、55-90%、或60-90%。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述淫羊藿黄酮含淫羊藿苷(C33H40O15)为10-90%(重量/重量),或者为15-85%、20-80%、25-80%、30-80%、35-80%、40-75%、40-70%、20-90%、30-90%、40-90%、50-90%、55-90%、或60-90%。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症是各种原因导致的出现髓鞘病损的疾病和/或病症。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症是神经系统脱髓鞘疾病。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症选自:多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病。根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症选自:缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病、糖尿病性神经病、系统性红斑狼疮。本发明第二方面提供一种组合物,其包含有效量的式I化合物、包含式I化合物的淫羊藿、包含式I化合物的淫羊藿黄酮、或者包含式I化合物的淫羊藿提取物,以及任选的药学可接受的载体;所述式I化合物具有下式结构:                      其中,R1选自H、卤素、-C1-6烷基、-C(O)-C1-4烷基。根据本发明第二方面任一项的组合物,其中所述式I化合物的R1选自H、F、Cl、Br、-C1-4烷基、-C(O)-C1-2烷基。根据本发明第二方面任一项的组合物,其中所述式I化合物为以下式Ia化合物:                      根据本发明第二方面任一项的组合物,其中所述式I化合物为淫羊藿苷。根据本发明第二方面任一项的组合物,其可用于治疗、预防、减轻和/或缓解与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症,或者其可用于减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复。根据本发明第二方面任一项的组合物,其中包含有效治疗、预防、减轻和/或缓解与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症的量的式I化合物,或者其中包含有效减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复的量的式I化合物。根据本发明第二方面任一项的组合物,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症是各种原因导致的出现髓鞘病损的疾病和/或病症。根据本发明第二方面任一项的组合物,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症是神经系统脱髓鞘疾病。根据本发明第二方面任一项的组合物,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症选自:多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病。根据本发明第二方面任一项的组合物,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症选自:缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病、糖尿病性神经病、系统性红斑狼疮。本发明第三方面提供可用于治疗、预防、减轻和/或缓解与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症或者可用于减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复的以下式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物:                      其中,R1选自H、卤素、-C1-6烷基、-C(O)-C1-4烷基。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述式I化合物的R1选自H、F、Cl、Br、-C1-4烷基、-C(O)-C1-2烷基。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述式I化合物为以下式Ia化合物:                      根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述式I化合物为淫羊藿苷。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述淫羊藿、淫羊藿黄酮或淫羊藿提取物包含治疗、预防、减轻和/或缓解有效量的淫羊藿苷。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述淫羊藿按干燥品计,含淫羊藿苷(C33H40O15)不少于0.5%(重量/重量),或者不少于1.0%、2.0%、或5.0%。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述淫羊藿黄酮含淫羊藿苷(C33H40O15)为20-90%(重量/重量),或者为25-85%、30-80%、35-802、40-802、45-802、50-752、50-702、30-902、40-90%、50-90%、55-90%、或60-90%。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述淫羊藿黄酮含淫羊藿苷(C33H40O15)为10-90%(重量/重量),或者为15-85%、20-80%、25-80%、30-80%、35-80%、40-75%、40-70%、20-90%、30-902、40-902、50-902、55-902、或60-902。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症是各种原因导致的出现髓鞘病损的疾病和/或病症。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症是神经系统脱髓鞘疾病。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症选自:多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病。根据本发明第三方面任一项的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症选自:缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病、糖尿病性神经病、系统性红斑狼疮。本发明第四方面提供对有需要的受试者治疗、预防、减轻和/或缓解与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症的方法,或者对有需要的受试者减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗、预防、减轻、缓解、和/或促进有效量的以下式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物:                      其中,R1选自H、卤素、-C1-6烷基、-C(O)-C1-4烷基。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述式I化合物的R1选自H、F、Cl、Br、-C1-4烷基、-C(O)-C1-2烷基。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述式I化合物为以下式Ia化合物:                      根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述式I化合物为淫羊藿苷。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述淫羊藿、淫羊藿黄酮或淫羊藿提取物包含治疗、预防、减轻和/或缓解有效量的淫羊藿苷。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述淫羊藿按干燥品计,含淫羊藿苷(C33H40O15)不少于0.5%(重量/重量),或者不少于1.0%、2.0%、或5.0%。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述淫羊藿黄酮含淫羊藿苷(C33H40O15)为20-90%(重量/重量),或者为25-85%、30-80%、35-80%、40-80%、45-80%、50-75%、50-70%、30-90%、40-90%、50-90%、55-90%、或60-90%。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述淫羊藿黄酮含淫羊藿苷(C33H40O15)为10-90%(重量/重量),或者为15-85%、20-80%、25-80%、30-80%、35-80%、40-75%、40-70%、20-90%、30-90%、40-90%、50-90%、55-90%、或60-90%。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症是各种原因导致的出现髓鞘病损的疾病和/或病症。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症是神经系统脱髓鞘疾病。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症选自:多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述与神经系统髓鞘病损有关的疾病和/或病症选自:缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病、糖尿病性神经病、系统性红斑狼疮。根据本发明第四方面任一项的方法,其中所述有效量的式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物,按淫羊藿苷计,为每千克受试者体重每天给予约0.001μg至约1000mg的量。在一个实施方案中,所述有效量为约0.01μg至约500mg/kg/天、约0.1μg至约250mg/kg/天、约1μg至约100mg/kg/天、约10μg至约100mg/kg/天、约50μg至约100mg/kg/天、约100μg至约100mg/kg/天、约1000μg至约50mg/kg/天、约50μg至约500mg/kg/天、约0.01μg至约500mg/kg/天、或约0.1μg至约250mg/kg/天。本发明任一方面或该任一方面的任一项所具有的特征同样适用于其它任一方面或该其它任一方面的任一项。在本发明中,例如,提及“本发明第一方面任一项”时,该“任一项”是指本发明第一方面的任一子方面,在其它方面以类似方式提及时,亦具有相同含义。。        发明详述:              下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所有文献,它们的全部内容通过引用并入本文,并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时,以本发明的表述为准。此外,本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义,即便如此,本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释,提及的术语和短语如有与公知含义不一致的,以本发明所表述的含义为准。如本文所述的,术语“淫羊藿”符合2005年版《中国药典》“淫羊藿”项下的规定。如本文所述的,术语“淫羊藿黄酮(Epimedium flavanoids)”是淫羊藿的主要有效组分,淫羊藿黄酮中包括有淫羊藿苷(icariin)、宝藿苷(baohuoside)、朝藿定(epimedin)等,其中淫羊藿苷为其主要活性成分。在一个实施方案中,所述“淫羊藿黄酮”亦可指淫羊藿经提取获得的、包含(但不限于)以上有效活性成分的活性成分群;从而,在一个实施方案中,该所述“淫羊藿黄酮”亦可指淫羊藿提取物。如本文所述的,术语“淫羊藿提取物”是以淫羊藿药材根据已有方法提取所得的一种提取物,其中可包含淫羊藿黄酮以及主要有效成分淫羊藿苷。如本文所述的,术语“卤素”是指氟、氯、溴、或碘。如本文所述的,术语“C1-6烷基”是指包含1至6个碳原子的直链或支链烷基基团,并且其可包括其子集例如C1-5烷基、C1-4烷基、C1-3烷基,还可包括其具体的基团,例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。如本文所述的,术语“-C(O)-C1-4烷基”是指C1-4烷基酰基基团以及它们的子集例如-C(O)-C1-3烷基、-C(O)-C1-2烷基,以及甲酰基、乙酰基、丙酰基等。如本文所述的,术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症,或者实现减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复的剂量。如本文所述的,术语“组合物”,其还可以是指药物组合物,可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症,或者实现减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复。如本文所述的,术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明式I化合物或者包含式I化合物的淫羊藿、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、或组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症,或者实现减轻髓鞘脱失和/或促进髓鞘修复的动物,特别是哺乳动物,例如人、狗、猴、牛、马等。如本文所述的,术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态,该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。如本文所述的,“%”,如未特别指明,是指重量/重量的百分比。如本文所述的,术语“实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型”是研究人类多种神经系统脱髓鞘疾病的重要工具,包括任何条件诱导的EAE动物模型。本发明涉及淫羊藿黄酮(Epimedium flavanoide)及其有效成分淫羊藿苷(Icarrin)在制备防治神经系统脱髓鞘疾病的药物中的用途,以及用所述药物治疗神经系统脱髓鞘疾病的方法。本发明还涉及用于治疗或预防神经系统脱髓鞘疾病的含淫羊藿黄酮或其有效成分淫羊藿苷的药物组合物。本发明发现,淫羊藿黄酮及其有效成分淫羊藿苷具有减轻神经系统髓鞘脱失和炎性细胞浸润的病理变化、促进髓鞘的形成和修复、抑制炎性反应、调节细胞免疫等作用;进而,它们可用于制备防治神经系统脱髓鞘疾病的药物,并且可用于治疗与神经系统髓鞘病损相关疾病的方法。在一个实施方案中,本发明淫羊藿黄酮中淫羊藿苷的含量为40%-90%,例如约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%,特别是例如约60%。淫羊藿苷(C33H40O15,系统命名为:3-((6-脱氧吡喃甘露糖基)氧基)-7-(吡喃葡糖基氧基)-5-羟基-2-(4-甲氧基苯基)-8-(3-甲基-2-丁烯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮;分子量:676.65),结构如下:                      淫羊藿提取物、淫羊藿黄酮和淫羊藿苷可以由市售购得,并且它们的含有不同含量的淫羊藿苷的产品亦可由市售购得。它们可用于减轻神经系统髓鞘脱失和炎性细胞侵润,抑制炎症反应,抗氧化应激,促进髓鞘的形成、再生和修复,以及调节细胞免疫等;特别用于治疗各种原因导致的中枢和周围神经系统脱髓鞘疾病,包含但不仅于多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病、糖尿病性神经病、系统性红斑狼疮的神经病变等。本发明也可用于预防上述疾病。在一个实施方案中,本发明提供了含有淫羊藿黄酮和/或淫羊藿苷的药物组合物,以及用所述药物组合物治疗或预防神经系统脱髓鞘疾病的方法。本发明的淫羊藿黄酮和/或淫羊藿苷可按照本领域的常规技术经与可药用载体混合制成药物组合物或各种常规剂型,并按常规给药方式给药。适当的给药剂量可由主治医师根据疾病的性质、疾病的严重程度、患者的年龄和体重等因素决定。由此,本发明还涉及淫羊藿苷类似物在治疗各种原因导致的以髓鞘脱失为特征的神经系统疾病的用途。淫羊藿苷类似物是指与淫羊藿苷的实质性结构具有相似性的分子,例如其化学基团由保护基保护后形成的分子。例如,其5-位羟基被C1-6烷基或卤素取代的衍生物以及其与可药用有机酸如乙酸或无机酸如盐酸等形成的酯。适当的保护基是本领域技术人员公知的。本领域技术人员容易从淫羊藿苷作为前体物质合成5-位羟基被本发明所述R1基团取代的衍生物,并且所述5-位羟基被本发明所述R1基团取代的衍生物在体内可以转化为母体化合物淫羊藿苷,进而发挥疗效。因此,根据本发明上下文所详细记载的内容,可以预期5-位羟基被本发明所述R1基团取代的衍生物亦具有本发明所述的药理活性。本发明的组合物的有效组份可以从任何合适来源获得。例如,它们可以是提纯的形式或者它们可以是草药的形式,或者优选地是草药的提取物形式,或草药的园艺或植物等价物形式,或草药提取物的化学或功能等价物形式,也可以通过几种化学合成物的配方获得。本发明组合物预计口服给药,虽然给药可以通过任何合适方式,例如静脉内、鼻内、腹膜内、皮下、肌内、局部、栓剂途径或植入(缓慢释放分子)。该组合物的药用形式可以是适于注射用,例如无菌水溶液和用于临时配制无菌注射液或分散液的无菌粉末。宽广的剂量范围可以适用,取决于患者、病情的严重性和用于给药的途径和介质。在这种有治疗作用的组合物中活性化合物的量是将获得适宜的剂量。制备按照本发明的优选的组合物,这样口服剂量单元形式包含约0.01μg至约2000mg之间活性化合物。可选的量包括约1.0μg至约1500mg之间,约1μg至约1000mg之间和约10μg至约500mg之间。主要活性成分或成分组以有效量与合适的药学上可接受的载体被配制在剂量单元形式中用于方便和有效的给药。一个剂量单元形式例如每100g可以包含0.01μg至约2000mg量的主要活性化合物。以比例表达,所述活性化合物通常存在于约0.5μg至约2000mg/ml载体中。在包含补充活性成分的组合物中,参考常用剂量和给予所述成分的方式来决定剂量。或者,给予的剂量可以按照每千克体重的量的形式被提出。在这种情况下,每千克体重可以给予约0.001μg至约1000mg的量。本发明考虑的优选的范围包括每千克体重50μg至500mg或约每千克体重约0.01μg至约500mg或大约0.1μg至约250mg。
    具体实施方式
    通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述,然而,本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。在下文实验例中,如未特别说明,所述的淫羊藿黄酮含有60%的淫羊藿苷,并且该淫羊藿黄酮购自:陕西贵德高科技生物有限公司。此外,在下文实验例中,如未特别说明,所述的淫羊藿苷纯度大于97%(以C33H40O15计),并且该淫羊藿苷购自:西安赛德有机科技有限责任公司。        实验例1、淫羊藿黄酮对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型                大鼠神经功能损伤的影响              大鼠模型制备及给药:实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型是研究人类多种神经系统脱髓鞘疾病的重要工具。本实验中EAE大鼠模型的制备是使用豚鼠脊髓和大脑灰质匀浆液与完全弗氏佐剂乳化后于尾根部皮下多点免疫雌性Lewis大鼠。淫羊藿黄酮灌胃给药3周。神经功能检测方法:每日采用盲法由两名实验人员观察大鼠行为学变化,直至免疫后2周。神经功能损伤评分标准:0分,无症状;1分,尾部张力消失,可见轻度步态笨拙;2分,双后肢无力,步行困难;3分,双后肢瘫痪;4分,双后肢瘫痪及前肢无力;5分,四肢瘫痪;6分,濒死状态或死亡。实验结果:EAE模型组大鼠于免疫后第8天开始出现运动功能障碍,于第12天达到高峰。淫羊藿黄酮具有显著降低模型动物神经功能损伤的作用(表1),表明淫羊藿黄酮有利于改善疾病所致肢体麻木、平衡失调、瘫痪等临床症状。表1、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型发病高峰期神经功能损伤的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比;P<0.05,**P<0.01,用药组与模型组相比。“正常对照”,在全文中出现时,如未另外说明,是指未作EAE处理亦未给予活性物质的正常的动物组。        实验例2、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型神经系统髓鞘脱失和炎                性细胞侵润的影响              实验目的:本实验通过Luxol Fast Blue(LFB)染色观察EAE模型大鼠脊髓组织髓鞘脱失情况;应用苏木精-伊红(HE)染色观察模型大鼠脊髓组织的病理形态学变化,尤其是炎性细胞侵润情况;并研究淫羊藿黄酮对上述病理改变的干预作用。实验方法:大鼠于实验第14天经10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓组织行石蜡切片,片厚4μm。(1)LFB染色,镜下观察,根据如下标准进行评分:0分,无髓鞘脱失;1分,一个小范围髓鞘脱失;2分,2或3个小范围髓鞘脱失;3分,1到2个大范围髓鞘脱失;4分,大范围髓鞘脱失累及20%以上白质区域。(2)HE染色,镜下观察,根据如下标准进行评分:0分,无细胞侵润;1分,脊膜细胞侵润;2分,1到4个血管周围小范围细胞侵润;3分,5个以上血管周围小范围细胞侵润,或1个以上累及实质的大范围细胞侵润;4分,大量细胞侵润累及20%以上白质区域。实验结果:形态学上,EAE模型组大鼠脊髓腰膨大和脑片HE染色显示,小血管周围有大量炎性细胞侵润;LFB髓鞘染色可见大小不等的片状脱髓鞘区;电镜下可见病灶处有髓鞘破坏,同时还有血管、神经元、轴突的损伤。淫羊藿黄酮能减轻EAE模型大鼠脊髓腰膨大和脑实质炎性细胞侵润和髓鞘脱失的病理变化,保护神经元、少突胶质细胞的正常结构,抑制模型大鼠星形胶质细胞的异常活化(表2)。表明淫羊藿黄酮可用于防治各种原因导致的神经系统髓鞘病损疾病。表2、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型脊髓腰膨大病理染色评分的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例3、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型炎性细胞因子IL-1β含                量的影响              实验目的:白细胞介素1β(IL-1β)是重要的炎性细胞因子,对炎症反应有促进作用。本实验应用免疫组织化学法检测EAE大鼠模型脊髓腰膨大部位IL-1β含量,并观察淫羊藿黄酮对其含量的影响。实验方法:大鼠经10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓组织行冰冻切片。IL-1β一抗孵育,加相应二抗、三抗,DAB显色,镜下观察。用Image Pro plus5.0软件进行图象分析。实验结果:EAE模型组大鼠脊髓腰膨大中IL-1β阳性细胞数明显高于正常对照组,且细胞染色较深;而淫羊藿黄酮能减少模型大鼠IL-1β阳性细胞数,且染色变浅(表3)。表明淫羊藿黄酮可明显抑制神经系统炎性细胞因子IL-1β的产生,有利于抑制神经炎症反应。表3、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型脊髓腰膨大IL-1β含量的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,P<0.05,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例4、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型炎性细胞因子TNF-α含                量的影响              实验目的:肿瘤坏死因子α(TNF-α)是重要的炎性细胞因子,对炎症反应有促进作用。本实验应用酶联免疫法(ELISA)检测EAE大鼠模型大脑皮层TNF-α含量,并观察淫羊藿黄酮对其含量的影响。实验方法:大鼠麻醉后处死,取新鲜脑组织,制备大脑皮层匀浆液。操作方法严格按照ELISA试剂盒说明书中步骤。酶标仪450nm测其吸光度。根据测得的OD值在标准曲线上计算出相应TNF-α含量。实验结果:EAE模型组大鼠大脑皮层TNF-α含量明显高于正常对照组;而淫羊藿黄酮能减少模型大鼠大脑皮层TNF-α含量(表4),表明淫羊藿黄酮可减少炎性细胞因子,有利于抑制神经炎症反应。表4、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型大脑皮层TNF-α含量的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例5、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型大脑皮层NO含量和NOS                活性的影响              实验目的:一氧化氮合酶(NOS)催化一氧化氮(NO)的生成。炎性反应时诱导型NOS活性增高,产生过量NO,通过氧化产生氧自由基,可导致神经细胞和髓鞘的损害。本实验通过生化试剂盒检测EAE大鼠模型大脑皮层中NOS活性和NO含量,并观察淫羊藿黄酮对其变化的影响。实验方法:大鼠麻醉后处死,取新鲜脑组织,称重后用生理盐水以1∶10混匀后于冰浴中制备脑匀浆液,10000转/分钟离心10分钟,取上清液,沸水浴3分钟,10000转/分钟离心5分钟,取上清液0.1ml。操作方法严格按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行。实验结果:EAE模型组大鼠大脑皮层NOS活性和NO含量明显高于正常对照组;而淫羊藿黄酮能抑制模型大鼠大脑皮层NOS活性,减少NO含量(表5)。表明淫羊藿黄酮可能通过抑制NOS活性,减少NO分泌,从而减轻神经细胞和髓鞘的病理损害。表5、淫羊藿黄酮对EAE模型大鼠大脑皮层NOS活性和NO含量的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例6、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型神经系统氧化应激的影                              实验目的:氧自由基与细胞膜、细胞器膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,使膜磷脂破坏降解而变性失能。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的代谢产物,MDA增高表明脂质过氧化增强,可对神经细胞和髓鞘造成损伤。超氧化物歧化酶(SOD)可清除超氧阴离子,是体内重要的抗氧化酶。本实验通过生化方法检测EAE大鼠模型脑组织中SOD活性和MDA含量,并观察淫羊藿黄酮对其变化的影响。实验方法:大鼠麻醉后处死,取新鲜脑组织,称重后用生理盐水以1∶10混匀后于冰浴中制备脑匀浆液,10000转/分钟离心10分钟,取上清液,沸水浴3分钟,10000转/分钟离心5分钟,取上清液0.1ml。严格按照南京建成生物工程研究所提供的生化试剂盒测定SOD活性和MDA含量。实验结果:与正常对照大鼠相比,EAE模型大鼠大脑皮层SOD活性显著降低,MDA含量明显升高;而淫羊藿黄酮能显著增加模型大鼠大脑皮层SOD活性,减低MDA含量(表6),表明淫羊藿黄酮能够增强抗氧化能力,抑制脂质过氧化反应,有利于保护神经细胞和髓鞘。表6、淫羊藿黄酮对EAE模型大鼠大脑皮层SOD活性和MDA含量的影响均值±SD;#P<0.05,模型组与正常对照组相比,P<0.05,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例7、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型神经系统少突胶质细胞                含量的影响              实验目的:髓鞘是由少突胶质细胞的突起形成。2′,3′-环腺苷酸-3′-磷酸二酯酶(CNPase)是成熟少突胶质细胞的标志蛋白。本实验通过Western blot法检测EAE大鼠模型大脑皮层CNPase含量,应用免疫组织化学法检测脊髓腰膨大部位CNPase含量,并观察淫羊藿黄酮对其含量的影响。        (1)Western blot法检测大脑皮层CNPase含量              实验方法:大鼠麻醉后处死,取大脑皮层,冰上裂解提取总蛋白,制备Western blot样品,加CNPase一抗孵育,加相应二抗,ECL显色,Kodak胶片曝光。用Image J软件对图片进行分析并经β-肌动蛋白(β-actin,作为内参)标化。实验结果:EAE模型组大鼠大脑皮层CNPase条带与对照组相比明显变细,整合灰度明显降低,表明少突胶质细胞数量减少;而淫羊藿黄酮组大鼠CNPase条带变粗,整合灰度明显增加(表7)。表明淫羊藿黄酮可明显增加少突胶质细胞数量,有利于髓鞘的形成。表7、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型大脑皮层少突胶质细胞含量的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,**P<0.01,用药组与模型组相比        (2)免疫组织化学法检测脊髓腰膨大部位CNPase含量              实验方法:大鼠于实验第14天经10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓组织行冰冻切片。CNPase一抗孵育,加相应二抗、三抗,DAB显色,镜下观察。用Image Pro plus5.0软件对图片进行阳性细胞计数分析。实验结果:EAE模型大鼠脊髓腰膨大部位CNPase阳性细胞数量与正常对照组相比明显减少,表明少突胶质细胞数量减少;而淫羊藿黄酮用药组CNPase阳性细胞数量显著增高(表8),表明淫羊藿黄酮可增加少突胶质细胞数量,有利于髓鞘的形成。表8、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型脊髓腰膨大少突胶质细胞数量的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,P<0.05,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例8、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型神经生长因子含量的影                              实验目的:神经营养因子是构成神经再生微环境的重要物质。神经生长因子(NGF)是重要的神经营养因子,可促进神经细胞和髓鞘的再生和修复。本实验通过免疫组织化学法检测EAE大鼠模型脊髓腰膨大中NGF含量,并观察淫羊藿黄酮对其含量的影响。实验方法:大鼠经10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓组织行冰冻切片。NGF一抗孵育,加相应二抗、三抗,DAB显色,镜下观察。用Image Pro plus5.0软件进行图象分析。实验结果:通过软件对图片累积光密度值(IOD)进行分析,发现EAE模型组大鼠脊髓腰膨大中NGF阳性细胞数明显低于正常对照组;而淫羊藿黄酮组NGF表达明显升高,且细胞着色较深(表9)。表明淫羊藿黄酮可明显增加神经系统中NGF的生成和分泌,进而能够促进神经细胞和髓鞘的再生和修复。表9、淫羊藿黄酮对EAE模型大鼠脊髓腰膨大NGF表达的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,P<0.05,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例9、淫羊藿黄酮对EAE大鼠模型脑源性神经营养因子含                量的影响              实验目的:神经营养因子是构成神经再生微环境的重要物质。脑源性神经营养因子(BDGF)是重要的神经营养因子,可促进髓鞘再生和修复。本实验通过免疫组织化学法检测EAE大鼠模型脊髓腰膨大中BDGF含量,并观察淫羊藿黄酮对其含量的影响。实验方法:大鼠经10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓组织行冰冻切片。BDNF一抗孵育,加相应二抗、三抗,DAB显色,镜下观察。用Image Pro plus5.0软件进行图象分析。实验结果:通过软件对BDNF阳性细胞总面积(area)和累积光密度值(IOD)进行分析,EAE模型组大鼠脊髓腰膨大中BDNF表达明显低于正常对照组;而淫羊藿黄酮组BDNF表达明显升高(表10),表明淫羊藿黄酮可通过增高神经营养因子改善神经再生微环境,从而促进髓鞘再生和修复。表10、淫羊藿黄酮对EAE模型大鼠脊髓腰膨大BDGF表达的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,P<0.05,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例10、淫羊藿苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模                型神经功能损伤的影响              小鼠模型制备及给药:实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型是研究人类多种神经系统脱髓鞘疾病的重要工具。本实验中EAE小鼠模型的制备是应用髓鞘少突胶质细胞表面糖蛋白MOG35-55免疫雌性C57BL/6J小鼠。即小鼠脊柱背侧部皮下注射0.2mL的MOG35-55抗原配剂,分别于免疫注射的即刻和48小时后腹腔注射0.2mL百日咳杆菌液。淫羊藿苷于最后一次注射百日咳杆菌后开始灌胃给药,连续3周。神经功能检测方法:每日采用盲法由两名实验人员观察小鼠行为学变化。神经功能损伤评分标准:0分,无症状;1分,尾部张力降低,可见轻度步态笨拙;2分,尾部张力消失,中度步态异常,姿态维持缺乏;3分,肢体力弱;4分,肢体麻痹;5分,濒死状态或死亡。实验结果:EAE模型组小鼠于免疫后第8天开始出现运动功能障碍,于第15天左右达到高峰。淫羊藿苷具有显著降低模型动物神经功能损伤评分的作用(表11),表明淫羊藿苷有利于改善疾病所致肢体麻木、平衡失调、瘫痪等临床症状。表11、淫羊藿苷对EAE小鼠模型发病高峰期神经功能损伤评分的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例11、淫羊藿苷对EAE小鼠模型神经系统髓鞘脱失的影响              实验目的:通过Luxol Fast Blue(LFB)染色检测EAE小鼠模型脊髓组织髓鞘脱失情况;并观察淫羊藿苷对该病理改变的干预作用。实验方法:小鼠于实验第29天经10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓组织行石蜡切片,片厚5μm。LFB染色,镜下观察,根据如下标准进行评分:0分,无髓鞘脱失;1分,一个小范围髓鞘脱失;2分,2或3个小范围髓鞘脱失;3分,1到2个大范围髓鞘脱失;4分,大范围髓鞘脱失累及20%以上白质区域。实验结果:EAE模型组小鼠脊髓出现明显髓鞘脱失现象,而淫羊藿苷用药组髓鞘脱失显著减轻(表12),表明淫羊藿苷可用于防治各种原因导致的神经系统髓鞘病损疾病。表12、淫羊藿苷对EAE小鼠模型脊髓组织髓鞘脱失的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例12、淫羊藿苷对EAE小鼠模型神经系统炎性细胞侵润的                影响              实验目的:通过苏木精-伊红(HE)染色检测EAE小鼠模型脊髓的病理变化,尤其炎性细胞侵润的情况;并观察淫羊藿苷对该病理改变的影响。实验方法:小鼠于实验第28天经10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓组织行石蜡切片,片厚5μm。HE染色,镜下观察,根据如下标准进行评分:0分,无细胞侵润;1分,脊膜细胞侵润;2分,1到4个血管周围小范围细胞侵润;3分,5个以上血管周围小范围细胞侵润,或1个以上累及实质的大范围细胞侵润;4分,大量细胞侵润累及20%以上白质区域。实验结果:EAE模型组小鼠脊髓组织出现明显的炎性细胞侵润,而给予淫羊藿苷组炎性细胞侵润明显减轻(表13),表明淫羊藿苷可减轻神经炎症反应,有利于防治神经系统炎性脱髓鞘疾病。表13、淫羊藿苷对EAE小鼠模型脊髓组织炎性细胞侵润的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比;P<0.05,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例13、淫羊藿苷对EAE小鼠模型血清炎性细胞因子含量的                影响              实验目的:白细胞介素1(IL-1)和IL-6是重要的炎性细胞因子,对炎症反应有促进作用。本实验通过酶联免疫法(ELISA)检测EAE小鼠模型血清中IL-1和IL-6含量,并观察淫羊藿苷对其含量的影响。实验方法:小鼠戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,室温静置2小时,3000转/分钟离心20分钟,取上清,-80℃保存备用。操作方法严格按照ELISA试剂盒说明书中步骤。酶标仪450nm测其吸光度。根据测得的OD值在标准曲线上计算出相应IL-1和IL-6含量。实验结果:EAE模型组小鼠血清IL-1和IL-6含量明显高于正常对照组;而淫羊藿苷能减少模型小鼠血清中IL-1和IL-6含量(表14)。表明淫羊藿苷可抑制炎症反应。表14、淫羊藿苷对EAE小鼠模型血清中IL-1和IL-6含量的影响均值±SD;##P<0.01,模型组与正常对照组相比,P<0.05,**P<0.01,用药组与模型组相比。        实验例14、淫羊藿苷对EAE小鼠模型外周血T细胞亚群的影响              实验目的:自身免疫性疾病的一个共同特点是CD4+T细胞减少,而CD8+T细胞增多。本实验通过流式细胞仪(FACS)检测EAE小鼠模型外周血T细胞亚群中CD4+、CD8+细胞数量,以及二者的比率;并观察淫羊藿苷对这些变化的影响。实验方法:小鼠戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,室温静置2小时,3000转/分钟离心20分钟,取细胞,加入不同标记的抗CD4+、CD8+T细胞抗体孵育,用流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞在T淋巴细胞中所占百分比,并计算CD4+/CD8+T细胞的比率。实验结果:与正常对照组相比,EAE模型组小鼠外周血中CD4+T细胞明显降低,而CD8+T细胞显著增高,CD4+/CD8+T细胞比率明显降低。而淫羊藿苷能增加模型小鼠外周血中CD4+T细胞,降低CD8+T细胞,增高CD4+/CD8+T细胞比率(表15)。表明淫羊藿苷可调节T淋巴细胞免疫异常,使CD4+/CD8+T细胞比率趋于正常,进而能够防治自身免疫性疾病。表15、淫羊藿苷对EAE小鼠模型外周血T细胞亚群的影响均值±SD;#P<0.05,模型组与正常对照组相比,P<0.05,用药组与模型组相比。        实验例15、淫羊藿苷对EAE小鼠模型神经系统少突胶质细胞含                量的影响              实验目的:髓鞘是由少突胶质细胞的突起形成。CNPase、髓鞘碱性蛋白(MBP)为成熟少突胶质细胞的标志蛋白。本实验通过Western blot法观察EAE模型小鼠脊髓中CNPase、MBP的表达,以代表少突胶质细胞含量;并观察淫羊藿苷对其的影响。实验方法:小鼠麻醉后处死,冰上取新鲜脊髓,冰上裂解提取总蛋白,制备Western blot样品,分别加CNPase、MBP一抗孵育,加相应二抗,ECL显色,Kodak胶片曝光。用Image J软件对图片进行分析并经β-actin标化。实验结果:EAE模型组小鼠脊髓CNPase、MBP条带与对照组相比明显变细,整合灰度明显降低,表明少突胶质细胞数量减少;而淫羊藿苷用药组CNPase、MBP条带变粗,整合灰度明显增加(表16)。表明淫羊藿苷可明显增加成熟少突胶质细胞数量,有利于髓鞘的分泌和形成,进而能够防治神经系统脱髓鞘疾病。表16、淫羊藿苷对EAE小鼠模型脊髓少突胶质细胞含量的影响均值±SD;#P<0.05,模型组与正常对照组相比,P<0.05,用药组与模型组相比。综上所述,淫羊藿黄酮、淫羊藿苷在多种动物模型上表现出明显的减轻神经系统髓鞘脱失和炎性细胞侵润、抑制炎性反应、抗氧化应激、增多少突胶质细胞数量从而有利于髓鞘形成、增多神经营养因子从而促进神经细胞和髓鞘再生和修复、以及增加外周血CD4+T细胞数量、减少CD8+T细胞数量等作用,可用于防治各种原因导致的中枢和周围神经系统脱髓鞘疾病。

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