一种基于微生物群落变化的水产养殖病害预测方法

本发明公开了一种基于微生物群落变化的水产养殖病害预测方法，特点是根据养殖水体中特征微生物群落相对丰度之和的变化来实现病害预测预警，具体包括：用高通量测序或其他方法获得健康水体样本和发病水体样本中的微生物群落信息，从中筛选出对健康状态和发病状态分别具有指示作用的健康特征微生物群落以及病害特征微生物群落，再以病害特征微生物组合中各微生物的相对丰度或健康特征微生物组合中各微生物的相对丰度作为自变量，以各样本的健康状态为因变量，分别建立预测模型对未知样本进行预测，优点是可用较少的指示微生物种类来预测水产养殖生物发生病害的可能性，预测准确性高。

技术领域
本发明涉及一种水产养殖病害预测预警的方法，尤其是涉及一种根据养殖水体中微生物群落的变化来实现病害预测预警的方法。 
背景技术
水产养殖特别是工厂化设施养殖生产中的病害问题是水产养殖行业面临的重大问题之一。各类突发性、暴发性的病害，经常给水产养殖行业造成巨大的经济损失。为防止病害的发生，除了采取各类相应管理和技术措施之外，还需要在病害发生前对可能产生的病害进行有效的预报或预警，并在此基础上有针对性地采取有效措施进行人工干预，从而防止病害发生或尽可能减少损失。水产养殖系统病害产生的原因十分复杂。养殖生物的生物学特性、致病微生物、养殖密度、管理水平、技术措施、水质条件以及突发性的环境变化等，都有可能是造成灾难性病害发生的诱因。 目前，水产养殖病害发生的预测预警方法运用最多的主要是通过检测病原菌、检测水质指标来进行病害预测预警。但是，在实际应用中，经常存在致病菌含量较低时出现暴发性病害，在致病菌含量较高时没有病害发生；并且，在水质指标与病害发生之间也难以找到必然的联系。因此，由于病害产生的复杂性，人们对水产养殖病害发生的机理还不完全清楚，因而其预测预警的准确率仍然很低。 现有研究表明，养殖过程中养殖生物的健康与发病状态与多种环境因素相关，养殖水体微生物群落是各种环境因素综合作用的结果，并能直接反映养殖生物的健康状态，因此可通过监测微生物群落的变化来指示养殖生物和养殖水体的健康状态。分子生物学技术的飞速发展，使得通过采用高通量测序或基因芯片等技术手段实现养殖水体中微生物的全面快速监测成为可能，从而使得通过监测微生物的变化实现养殖生物病害预警预报成为可能。 然而，微生物之间存在功能冗余性、功能互补性、食物或养份的竞争性，以及适应环境条件的弹性，因此微生物对环境条件变化的响应以及对病害的形成原因非常复杂。   我们的研究认为，微生物对环境变化的响应以及对病害的作用是以群落形态出现的，研究微生物对环境条件的响应或评估其生态健康水平，需要从群落层次进行考察。如果存在某一子群落，该子群落的相对丰度之和在具有相同生态特征（如健康，或发病）的样本中保持相对稳定，而在具有不同生态特征（如健康与发病）的样本中具有显著差异，则可称该子群落为表征该生态特征的特征群落。如某一子群落由5种微生物组成，该5种微生物的相对丰度之和在所有健康样本中保持相对稳定，但与发病样本有显著差异，则称该子群落为健康特征群落。反之，则称为病害特征群落。健康状态下存在的某一比较稳定的微生物群落（健康特征群落），随着环境条件的变化将会发生相应变化；尽管其中的各种微生物的绝对数量都有可能发生较大变化，但这个群落作为一个整体，其在健康状态下的变化是相对稳定的，即其占整个养殖水体中所有各种微生物数量的比值（即相对丰度）之和是相对稳定的；如果这一结构发生较大变化，可能导致整个微生态系统平衡的崩溃，从而导致养殖生物的过度的应急反应，并产生连锁性、暴发性病灾；发病状态下，不仅健康状态下存在的比较稳定的微生物群落受到较大破坏，而且可能形成另外的、某一比较明显的、同样相对稳定的微生物群落（病害特征群落）；因此，既可通过健康特征群落的变化来评估养殖水体的健康状态，又可通过病害特征群落的变化来评估养殖水体的发病风险，二者可相互比较和印证。但是，目前国内外还没有公开任何关于基于微生物群落变化的水产养殖病害预测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于微生物群落变化并可用较少的指示微生物种类来预测水产养殖生物发生病害的可能性的，预测准确性高的水产养殖病害预测方法。 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 1、一种基于微生物群落变化的水产养殖病害预测方法，步骤如下：采用基因测序方法分别获得健康水体样本和发病水体样本中的微生物群落信息，根据微生物群落信息筛选出对健康状态具有指示作用的健康特征微生物群落，以及对发病状态具有指示作用的病害特征微生物群落，再以病害特征微生物组合中各微生物的相对丰度或健康特征微生物组合中各微生物的相对丰度作为自变量，以各样本的健康状态为因变量，分别建立预测模型对未知样本进行预测。2、所述的健康特征微生物群落和所述的病害特征微生物群落的筛选方法包括以下步骤： （1）设共有n个样本i，i=1,2…,n，所有样本通过高通量测序得出m种微生物j，j=1,2,…,m；计算每个样本中每一种微生物的reads数占该样本中所有微生物reads数的百分比x_ij，x_ij即为每一种微生物相对丰度；（2）根据各样本已知的健康或发病状态，将所有样本区分为病害样本和健康样本2组；分别计算每一种微生物j在发病组的均值ad_j以及在健康组的均值ah_j；如果ad_j> ah_j,　则将微生物j定义为疑似病害微生物j_d；反之，则定义为疑似健康微生物j_h；从而得出疑似病害微生物种类数为m_d，疑似健康微生物种类数为m_h;（3）对所有的m_d种疑似病害微生物j_d，计算每个样本去掉一种微生物j_d后剩下的其他微生物组合的相对丰度的和值s_ij；对病害组和健康组，用相对丰度的和值s_ij作显著性检验（t检验），得出其p值（即显著性检验值）p_jd，其中j_d=1,2,…,m_d；（4）如果去掉某疑似病害微生物j_d后的p值p_jd在所有参与计算的m_d种疑似病害微生物中最小，则去掉该疑似病害微生物，从而形成包括m_d-1种疑似病害微生物的组合；（5）重复（3）和（4），每次重复去掉一个疑似病害微生物，第k次重复，则去掉k个疑似病害微生物，直到剩下的疑似病害微生物的个数达到预先所指定的病害特征微生物最小种类数n_d；同时第k次重复形成包括m_d-k种疑似病害微生物的组合comb_k，其中k=1,2…，m_d-n_d，重复总次数为m_d-n_d；（6）对（3）～（5）步骤得到的m_d-n_d个疑似病害微生物组合comb_k，分别计算每个组合在各样本中的相对丰度的和值s_ik，并计算s_ik在病害样品组的均值asd_k和变异系数vsd_k以及s_ik在健康样品组的均值ash_k和变异系数vsh_k；对病害样本组和健康样本组，用s_ik作t检验，得出其p值p_k，其中k=1,2…，m_d-n_d；（7）对m_d-n_d个疑似病害微生物组合comb_k（_k=1,2…m_d-n_d），根据相对丰度和值s_ik对每一个样本i进行病害和健康样本的区分检验，即：如果某样本i的s_ik>asd_k，则将该样本判为病害样本；反之则将该样本判为健康样本；根据判别结果，计算微生物组合comb_k区分病害和健康样本的准确率分别为cd_k和ch_k； （8）指定以下参数：区分病害和健康样本的准确率均为c、相对丰度和值的均值asd及变异系数vsd、特征微生物最大个数nd_max和最小个数nd_min；根据指定参数及以上计算结果，对以上各种微生物的组合进行筛选，即筛选出符合以上指定参数的所有微生物组合；其中区分准确率最高、相对丰度和值的均值最大、变异系数最小的病害微生物组合，即为最佳病害微生物组合，称为病害特征微生物组合；符合以上指定参数的所有微生物组合指区分病害和健康样本的准确率均高于指定参数c，在病害样品组和在健康样品组的相对丰度和值的均值均大于指定参数asd，在病害样品组和在健康样品组的变异系数均小于指定参数vsd的疑似病害微生物组合comb_k；（9）在步骤（3）～(8)中，将所有疑似病害微生物替换为所有疑似健康微生物，重复以上（3）～(8)的过程，同理可得出健康特征微生物组合。3、所述的预测模型采用Logistic回归模型，其数学形式如下： 式中：P指养殖池塘的状态，其中健康状态取值为1，病害状态取值为0；X₁，X₂,…,X_n为自变量，指筛选出来的病害特征微生物或健康特征微生物，其取值为其中每种微生物的相对丰度x_ij；β₁，β₂,…,β_n，为Logistic回归模型的参数。4、所述预测模型中的自变量可以是筛选出来的病害特征微生物，也可以是健康特征微生物；由这两种方法所得的预测结果可以相互比较和印证。 5、所述微生物种类可以分别是分类学意义上的门、纲、目、科、属、种或OTU等分类水平；由不同分类水平计算所得的结果可以相互比较和印证。 与现有技术相比，本发明的优点在于：提供一种基于微生物群落变化的水产养殖病害预测方法，通过筛选出养殖水体病害特征微生物和健康特征微生物，从而可以用较少的指示微生物种类来预测养殖生物发生病害的可能性，为指示性基因芯片的研制提供基础，并为养殖水体微生物群落的人工调控指明方向。 
附图说明
图1为本发明的水产养殖病害预测方法流程示意图。 
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 具体实施例2012年上半年，分别在放苗后35d、45d、55d、63d、69d、77d时，采得南美白对虾海水养殖场34个养殖塘水样，每个塘1个样本；经过滤、DNA提取、PCR扩增等前处理后进行高通量测序(或其他方法如基因芯片、PCR-DGGE等)，得到各样本各微生物OTU的reads数，并将其转换为相对丰度。我们用其中63d和69d的18个样本（其中6个发病样本，12个健康样本）作为筛选特征微生物并建立预测模型的样本，并用其他样本作为预测样本。以不同分类水平（门、纲、目、科、属、种）的数据建模和预测时，除数据不同外，其流程与方法完全一致。实施流程参照图1。 以下用属的数据为例，说明具体流程与方法： 1. 筛选特征微生物(1)用于微生物筛选与建模的样本共有18个， i=1,2…,18，其中6个发病样本，12个健康样本；通过高通量测序共得出m个微生物属，j=1,2,…,m；计算每个样本中每一微生物属的相对丰度x_ij；(2)根据已知的各样本的健康或发病状态，将所有样本区分为病害样本和健康样本2组；计算每一种微生物j分别在发病组和健康组的相对丰度均值，分别为ad_j和ah_j; 如果ad_j> ah_j,　则将微生物j划分为疑似病害微生物；反之，则划分为疑似健康微生物；从而得出疑似病害微生物种类数为m_d=224属，疑似健康微生物种类数为m_h=296属；(3)对所有的m_d=224个属的疑似病害微生物j_d，计算每个样本去掉微生物j_d（j_d=1,2,…,m_d）后剩下的其他微生物组合的相对丰度和值s_ij；对病害组和健康组，用相对丰度和值s_ij作作显著性检验（t检验），得出其显著性检验值p_jd；(4)如果去掉某疑似病害微生物j_d后的p值p_jd在所有参与计算的疑似病害微生物中最小，则去掉该疑似病害微生物，从而形成包括m_d-1种疑似病害微生物的组合；(5)重复（3）和（4），每次重复（重复总次数为m_d-n_d）去掉一个疑似病害微生物，第k次重复（k=1,2…m_d-n_d）则去掉k个疑似病害微生物，直到剩下的疑似病害微生物的属数达到预先所指定的最小特征病害微生物属数n_d＝3；同时第k次重复形成包括m_d-k种疑似病害微生物的组合comb_k（k=1,2…m_d-n_d）；(6)对（3）～（5）形成的m_d-n_d＝224-3＝221个组合comb_k（k=1,2…221），分别计算每个组合在各样本中的相对丰度的和值s_ik，并计算s_ik在病害样品组的均值asd_k和变异系数vsd_k以及s_ik在健康样品组的均值ash_k和变异系数vsh_k；对病害样本组和健康样本组，用s_ik作t检验，得出其p值p_k，其中k=1,2…，m_d-n_d；(7)根据相对丰度和值s_ik对每一个样本i进行病害和健康样本的区分检验，即：如果某样本i的s_ik>asd_k，则将该样本判为病害样本；反之则将该样本判为健康样本；计算其区分病害和健康样本的准确率cd_k和ch_k;(8)指定以下参数：区分病害和健康样本的准确率c=0.6，相对丰度和值的均值asd=0.5，变异系数vsd=0.5、特征微生物最大个数nd_max=15和最小个数nd_min=3。根据指定参数对以上各种微生物的组合进行筛选（选取区分病害和健康样本的准确率均高于指定参数c=0.6，在病害样品组和在健康样品组的相对丰度和值的均值大于指定参数asd=0.5，在病害样品组和在健康样品组的变异系数均小于指定参数vsd=0.5的疑似病害微生物组合comb_k），得出病害特征微生物组合中各微生物属的名称为：a. DS001b. NS3a_marine_groupc. Saprospiraceae_unculturedd. Thalassospira （9）在步骤（3）～(8)中，将所有疑似病害微生物替换为所有疑似健康微生物，重复以上（3）～(8)的过程，得出健康特征微生物组合中各微生物属的名称为： a.Bacteria_P_218_C_1_O_1_F_1_G_1b.Bacteroidetes_C_22_O_1_F_1_G_1c.Candidate_division_OD1_C_48_O_1_F_1_G_1d.Candidatus_Aquiluna e.Chloroplast_O_132_F_1_G_1f.Chloroplast_O_71_F_1_G_1g.Erythrobacterh.Flavobacteriales_F_5_G_1m.Marivitan.PeM15_F_8_G_1o.Rickettsiap.Saprospiraceae_G_57q.Winogradskyella2. 建立预测模型用病害特征微生物组合（或健康特征微生物组合）中各微生物的相对丰度作为自变量，以各样本的健康状态（健康1，发病0）为因变量，建立Logistic预测模型；式中：P指养殖池塘的状态，其中健康状态取值为1，病害状态取值为0；X₁，X₂,…,X_n为自变量，指筛选出来的病害特征微生物或健康特征微生物，其取值为其中每种微生物的相对丰度x_ij；β₁，β₂,…,β_n，为Logistic回归模型的参数。自变量可以是筛选出来的病害特征微生物，也可以是健康特征微生物；由这两种方法所得的预测结果可以相互比较和印证。 微生物种类可以分别是分类学意义上的门、纲、目、科、属、种或OTU等分类水平；由不同分类水平计算所得的结果可以相互比较和印证。 3. 预测新样本健康状态 用健康状态未知的新样本中各特征微生物的相对丰度作为自变量，用以上建立的Logistic预测模型对其健康状态进行预测，可得分类水平为属时的预测结果；同样，采用其他分类水平也可得出其预测结果，如表1所示。表1不同分类水平预测的准确率（%） 由上表可见，采用不同的分类水平时，本发明对所有样本均有较好的预测效果；特别是对发病样本，其预测效果较为理想；采用病害特征群落进行预测的效果优于用健康特征群落进行预测的效果。当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。