能在简单节杆菌中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法及应用

本发明涉及一种能在简单节杆菌（Arthrobacter？Simplex）中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒在构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌中的应用。本发明质粒能在简单节杆菌里复制并且高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因，本发明质粒为进一步利用质粒pXJM19通过分子手段改良简单节杆菌提供了依据，具有重要的实用意义。<!--1-->

1.一种能在简单节杆菌(ArthrobacterSimplex)中复制并表达甾体类化合物A环1,2
位脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴以简单节杆菌基因组为模板进行PCR，所需要的引物如下：
P3：5′-CCGGAATTCATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′EcoRI；
P4：5′-CCCAAGCTTCATCGCGCGTCCTCGG-3′HindIII；
反应体系为50μL，配比如下：

其中，P1：5′-CCGGAATTCATGAGCCATATTCAACGGGAAAC-3′EcoRI；
P2：5′-CCCAAGCTTTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAT-3′HindIII；
PCR程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性45s；63℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸
10min；4℃保存；
再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段；
⑵构建游离表达载体pXJM19-ksdD
将目的基因通过EcoRI和HindIII双酶切连接在载体pXJM19多克隆位点上，得到重组载
体pXJM19-ksdD，所用连接酶为T4DNA连接酶，连接体系为20μL，连接体系如下：
目的基因与载体的摩尔浓度之比为3:1～9:1，加入0.2ul连接酶混匀后，在16℃下，过
夜反应；
经转化、验证构建成功后，即得能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,
2位脱氢酶基因的质粒。
2.如权利要求1所述的构建方法构建得到的质粒在构建高效表达甾体化合物A环1,2位
脱氢的简单节杆菌工程菌中的应用，
所述的构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌的步骤如下：
将冻存的简单节杆菌感受态细胞在冰上溶化后，取按感受态细胞：质粒为1μL：3ng的比
例加入质粒pXJM19-ksdD，混合均匀，使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物，电击参数
设置为：15kV/cm，25μF，电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基中，振荡培
养7～9h，复苏培养基连续稀释后取150μL涂布于含40μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，在培养
箱培养24-30小时，在抗性板上长出的菌落，即为高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单
节杆菌工程菌；
所述的复苏培养基为含有浓度为10-15mg/mL山梨醇的LB培养基。
3.如权利要求2构建的简单节杆菌工程菌在一次性投料的生物转化方面中的应用。