黄绿蜜环菌发酵液有效部位的制备方法及应用

本发明涉及一种黄绿蜜环菌发酵液有效部位的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴配制发酵培养液；⑵制备黄绿蜜环菌发酵液：发酵培养液灭菌后接入黄绿蜜环菌生产菌种发酵，即获得黄绿蜜环菌发酵液；⑶黄绿蜜环菌发酵液经减压浓缩至其体积的1/3~1/5时，即得黄绿蜜环菌发酵液浸膏；⑷黄绿蜜环菌发酵液浸膏经水提、浓缩、醇沉后分别得到上清液和醇沉物；醇沉物经真空冷冻干燥即得发酵液粗多糖有效部位；⑸上清液经丙酮提取、浓缩、过滤、色谱分离、干燥即得发酵液甾醇类有效部位；或上清液经减压浓缩、过MCI型树脂柱、洗脱、干燥即得核苷类有效部位。本发明工艺简单、易于实施。同时本发明还提供了该黄绿蜜环菌发酵液有效部位的应用。

1.黄绿蜜环菌发酵液粗多糖和甾醇类有效部位的制备方法，包括以下步骤：⑴配制发酵培养液：由10~30%马铃薯浸提液、10~30%豆芽浸提液、5~10%葡萄糖、1~5‰KH₂PO₄、1~5‰ MgSO₄、0.1~1‰微量盐、0.1~1mg/L VB₁、0.1~1mg/L VB₂配制而成的pH值为5.5~7.5的培养液；⑵制备黄绿蜜环菌发酵液：所述发酵培养液在温度为121℃、蒸汽压力为103KPa的条件下灭菌20min后，将其温度降至室温，并在该室温、无菌条件下，按5~10%的接种量接入黄绿蜜环菌生产菌种，在装料系数为65%~75%、搅拌速度为50~150rpm、通气量为0.1~0.3vvm、培养压力为0.01~0.05MPa、发酵温度为25~28℃条件下发酵10~15d，即获得黄绿蜜环菌发酵液；所述黄绿蜜环菌是指采集于青海省海北州祁连县的黄绿蜜环菌Armillaria luteo-virens按常规方法经组织分离获得的黄绿蜜环菌；所述黄绿蜜环菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO：7356；⑶所述黄绿蜜环菌发酵液经减压浓缩至其体积的1/3~1/5时，即得黄绿蜜环菌发酵液浸膏；⑷在所述黄绿蜜环菌发酵液浸膏中加入其体积5~10倍蒸馏水，在65~85℃下加热回流提取 1~3次，每次3h，抽滤，合并得到滤液；所述滤液经减压浓缩后得到浓缩液A，该浓缩液A中加入其5~10倍体积的体积浓度为95%的乙醇进行醇沉，12~24h后分别得到上清液和醇沉物；所述醇沉物经真空冷冻干燥即得发酵液粗多糖有效部位；⑸所述上清液用其体积10~30倍的丙酮在室温静置提取1~3次，每次提取60~84h，得到丙酮提取液，该丙酮提取液经减压浓缩后得到丙酮提取物；所述丙酮提取物中加入3~9倍体积的正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，得到溶解液，该溶解液过0.45μm有机滤膜，得到滤液；所述滤液在以10μm硅胶为分离基质的制备色谱上分离，收集目标馏分，该目标馏分经减压干燥即得发酵液甾醇类有效部位。
2.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌发酵液粗多糖和甾醇类有效部位的制备方法，其特征在于：所述步骤⑸中正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按 1 mL：1 mL的比例混合而成的溶液。
3.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌发酵液粗多糖和甾醇类有效部位的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶、步骤⑷、步骤⑸中的减压浓缩或减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~65℃。
4.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌发酵液粗多糖和甾醇类有效部位的制备方法，其特征在于：所述步骤⑷中的真空冷冻干燥的条件是指真空度为5~15Pa，干燥时间12~24h。